PCR仪、台式离心机、低温高速离心机、旋涡混匀器、稳压稳流电泳仪、水平电泳槽、紫外凝胶分析系统等
Trizol试剂
反转录酶
RNase抑制剂(40U/μl)，0.1mol／L DTT
随机引物或oligo¬-dT(18-20)
脱氧核苷三磷酸(dNTPs)
反转录缓冲液(5×)
Taq DNA聚合酶
特异性引物
PCR缓冲液(10×)，含MgCl2
DEPC处理水溶解RNA，-20℃保存，备反转录之用。
(1) 按下列组成调制反应液： 样品总RNA 1μg随机引物或oligo-dT(18-20) 100pmol脱氧核苷三磷酸(每种dNTP各l0mmol／L) 1μl反转录缓冲液(5×) 4μlRNase 抑制剂 (20~40U／μl ) 1μlM-MLV 反转录酶 20U DEPC处理水 补至20μl 阴性对照用DEPC处理水代替RNA模板，其余成分相同。将上述反应成分加于0.5ml EP管中，混匀，短时离心。
(2) 将各反应管放入PCR扩增仪上，37℃ 60min，70℃变性15min。反转录产物于4℃保存备用。
(1)按下列组成调制反应液： Taq DNA聚合酶 1.0U cDNA模板 1.0μl引物一对(各10pmol／μl) 1.0μl 脱氧核苷三磷酸(每种dNTP各2.5mmol／L) 2.0μl PCR缓冲液(10×，含MgCl2) 2.5μl 双蒸水 补至25.0μl 以反转录阴性对照取代cDNA模板作为PCR阴性对照，将上述反应成分加于0.2ml PCR管中，短暂离心，混匀。
(2) 将各PCR反应管放入DNA扩增仪，94℃5min，然后按以下条件进行热循环：94℃ 45s、56℃30s、72℃30s，循环30次，最后72℃延伸10min。
取PCR产物8μl 与 上样缓冲液2μl混合上样，适当大小的DNA Marker 一起电泳分离，溴乙锭染色，图像分析仪摄像并分析结果。
1．1％琼脂糖凝胶电泳记录结果。与DNA Marker相比，观察被检样品管的扩增产物位置，如与预期大小一致，且空白对照管中无扩增条带，说明本实验获得的条带与预期靶片段大小相符。
2．此方法的优点是可以由少量的mRNA(从1～2个哺乳动物细胞提取的mRNA)构成cDNA文库，RT-PCR可使所需模板的mRNA量大大减少。因此，对于低丰度mRNA的cDNA克隆及cDNA文库的构建非常有利。
1．在整个操作过程中，应避免RNA酶的污染，所用器材都需经特殊处理，另注意温度的调控，避免RNA的降解或失活。
2．抽提总RNA时应小心吸取上层水相转入EP管，注意勿吸取水相与有机相的界面层，此层含有DNA及蛋白质，会对PCR扩增有影响。
3．采用热启动PCR可减少非特异性PCR产物和引物二聚体的生成。
4．所提供的反转录试剂、PCR试剂会有所差异，具体的体系、反应的条件应根据实际情况调整。
5．PCR扩增的退火温度，时间与延伸温度，时间应根据扩增引物的Tm值，扩增长度，特异性以及所用Taq DNA聚合酶决定。
6．由于PCR技术的灵敏度高，极微量的污染也会造成扩增的假阳性结果。
7．临床诊断用PCR反应必须在专门的PCR实验室中进行，实验室应包括试剂配制室、模板制备室、PCR扩增室和产物检测室等功能区。PCR实验中的各个步骤应在相应的功能区中进行。