Primer Premier5软件
电脑
首先需要粘贴NCBI的网址，访问官网https://www.ncbi.nlm.nih.gov/在下拉选项框中选择【Gene】选项。点击【search】即可
点击需要的基因的超链接
到了一个新界面，在这里我们需要查找Smad4基因的所有外显子序列，所以需要找到【NW_.1 Alternate Oori1】所属的【gene bank】，点击进入即可。
在新的界面中，我们会看到Smad4基因长度达到了30028bp，编号从3840003到3870030。还有各外显子的具体位置。
为了将整个外显子全部扩增出来，我们在选取目的片段的时候会额外在目的片段两段多加200bp。根据外显子的位置和Smad4基因的起始序号，首先计算第一个外显子需要获取的序列为：从3839804 到3840453。直接在图中所框选的地方输入搜索即可！
直接出现我们需要的序列
接下来我们打开Primer Premier5软件。
把刚才搜索到的序列Ctrl+C复制后Ctrl+V后选择【As is】就可以将原序列复制进去了
然后点击【premier】-【search】-【sense premier】,在这里我们可以设置上下游引物的位置区域范围以及pcr扩增产物的长度等。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。引物长度一般在15~30碱基之间。G+C含量在40%~60%之间。碱基要随机分布，Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物5′端可以修饰。引物3′端不可修饰。引物3′端要避开密码子的第3位。在其他条件都满足的情况下（前四个检测不出现红色时），若ΔG的绝对值小于5也是可以的。
也可以通过调整引物的长度来寻找最适宜的引物
最好不要手动寻找合适的引物，因为那样找到的几率很低