细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多,有同位素标记法、细胞计数法等,这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。
工具/原料
1
仪器、用品:同常规细胞培养
2
试剂:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液
方法/步骤
1
细胞生长至指数期时,向培养液中加入BrdU,使最终浓度为10μg/ml。
2
44小时加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。
3
48小时后常规消化细胞至离心管中,注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。
4
常规染色体制片(见第三部分:染色体技术)。
5
染色体玻片置56℃水浴锅盖上,铺上2×SSC 液,距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。
6
弃去2×SSC液,流水冲洗。
7
Giemsa液染色10分钟,流水冲洗,晾干。
8
镜检100个分裂相,计第一、二、三、四细胞期分裂指数。
9
计算: 细胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小时)
注意事项
1
(1)BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。
2
(2)2×SSC配制: NaCl 1.75克,柠檬酸三钠•2H2O 0.88克,加水至100ml,4℃保存。 细胞的冻存和复苏
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