实验概要
学习和掌握DNA的微量提取法。
实验原理
小麦黄化苗经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如SDS），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用SDS法，其主要作用是破膜。SDS属阴离子去污剂，要溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。SDS在溶液中带负电荷，能与带正电荷的蛋白质侧链结合成复合物，当加入钾盐时，能与SDS－蛋白质生成溶解度很小的沉淀一同去除。酚/氯仿/异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质，并有利于水相与有机相的分开，而且可以消除泡沫。异丙醇或乙醇的作用是沉淀DNA。 处理DNA样品时，可在65℃保温30min，较之37℃处理有以下优点：RNA酶的最适作用温度为65℃；DNA酶最适作用温度为37℃，当用65℃处理时，这些酶往往处于活性极低的状态而不会降解DNA；RNA中的某些总分会形成发卡结构，65℃处理更有利于这些结构的松散，使RNA酶的作用更完全。
工具/原料
1
主要试剂
1. 提取缓冲液 100mmo/L NaCl 100mmol/L Tris-Cl（pH8.0） 50mmol/L EDTA 1%疏基乙醇 2. 20％SDS 3. 5mol/L醋酸钾 取29.5ml冰醋酸，用KOH颗粒调校至PH4.8，加水至100ml，室温保存，不可灭菌。 4. 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 5. 异丙醇 6. 70％乙醇
2
主要设备
1. 冰盘（4个）2. 研钵（8套）3. 塑料烧杯（8个）4. 200μl微量加样器（2把）5. 离心机（1台）6. 水浴锅（65℃）7. 枪头及EP管
3
实验材料
小麦黄花苗
方法/步骤
1
称取0.1g小麦黄化苗叶片于预冷的研钵中，加入3倍体积(W/V，约300μl) 提取缓冲液，在冰盘上研磨。
2
研碎后转入一EP管中，再加约300μl提取缓冲液。
3
加入20％SDS至终浓度为2％，约 66μl。
4
轻轻混匀后于65℃水浴，10min。
5
加入1/10体积的5mol/L醋酸钾(约66μl)，于水浴中反应 30min。
6
离心（15krpm，10min，4℃）。
7
取上相转入一新的EP管中，用等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提一次（上下晃动几次即可）。
8
离心（12krpm，10min，20℃）。
9
取上相转入一新的EP管中，加入等体积的异丙醇，于室温下反应5~10min，其间将管至少颠倒5次。
10
离心（15krpm，10min，4℃）。
注意事项
1
研磨后应迅速加入提取液，因为提取液中含EDTA，能够螯合Mg2 等二价阳离子，防止破碎细胞中的DNA酶降解DNA。
2
提取过程中，转移上清液时所用的枪头最好用剪刀将尖头剪去，以避免对DNA造成的不必要的机械损伤。
3
干燥DNA时，要注意，过干或过湿都不利于DNA的溶解。
上一篇：菌种鉴定——ANI
下一篇：microRNA二代测序分析流程