试剂和溶液
（1）1 × PBS
（2）2 × SDS 加样缓冲液（Laemmli缓冲液）
100 mM Tris-Cl（pH 6.8）
200 mM 二硫苏糖醇
20％甘油
4％SDS（电泳级别）
0.2％溴酚蓝
（3）Bio-Rad多带的已染色标准参照物（分子量参照物）
（4）SDS聚丙烯酰胺凝胶
（5）10 × SDS-PAGE电泳缓冲液
250 mM Tris碱
2.5 M 甘油
1％SDS
（6）转移缓冲液
25 mM Tris碱
2.5 M 甘氨酸
20％甲醇
（7）1 × TBST（Tris缓冲盐及吐温-20）
50 mM Tris-Cl(pH7.5)
150 mM 氯化钠
0.05％ 吐温-20
（8）封闭缓冲液
1 × TBST
5％无脂奶粉
（9）一抗
（10）10 × 丽春红S溶液
丽春红S 2 g
三氯醋酸 30 g
水杨酸磺酸 30 g
水 至100 ml
（11）一抗稀释缓冲液
1 × TBST
1％无脂奶粉
（12）与辣根过氧化物酶结合的二抗
（13）LumiGLO化学发光底物或其他增强的化学发光底物
设备
（1）Scotch-Brite 垫(3 M) 或相当的海绵
（2）Whatman 3 MM 滤纸
（3）转移膜
PVDF，硝酸纤维素膜，或中性(带正电荷)尼龙膜
（4）电泳转移设备
（5）记号笔
（6）摇动平台
（7）X光片
一、细胞的裂解 1. 用包含调节因子的培养基按所需的时间处理细胞。 2．吸去培养基，用PBS缓冲液漂洗培养细胞两次，然后彻底吸除PBS。 3. 加入1 × SDS载样缓冲液(6孔板每孔用100 µl或10 cm2盘用500 µl)裂解细胞。立即刮取裂解液转入微离心管，置于冰上。 4. 超声波处理10－15秒以剪切DNA和减少样本的粘性。室温下10000 × g 离心10分钟。将上清转至一新的离心管。 5. 测定蛋白的浓度。将20 µl样本煮沸5分钟，置于冰上冷却。
二、小型胶槽中样本蛋白的电泳 1. 加样至胶孔，注意使用蛋白参照物（10 µl Bio-Rad多带的已染色标准参照物）。 2. 恒定电流（35-37 mA，设置电压大于300 V）电泳约2.5小时。
三、组装转膜卡盒 1. 电泳完成后，卸下胶块，将其于室温下放入转移缓冲液中30分钟。 2. 将转移缓冲液加入一足够容纳塑料转膜卡盒的盘中，使卡盒浸入其中，并组装转膜装置。 3. 卡盒的底部放置Scotch-Brite垫或海绵，其上放置一片转移液浸湿的与胶块等同大小的滤纸。 4. 将胶置于滤纸上，凝胶与滤纸接触的面最终将面向负电极。驱除胶与滤纸间的气泡。 5. 剪制一片与胶块大小相仿的转移膜，使膜的边缘超出胶1-2 mm。将膜先置在蒸馏水（硝酸纤维素膜）或甲醇中（PVDF膜）浸湿，再将其置于转移缓冲液中浸泡5分钟。 6. 将浸湿的转移膜置于胶面上，驱除胶与膜间的气泡。 7. 于转移膜上再放置一片浸湿的滤纸，赶净气泡。再放置另一块Scotch-Brite垫或海绵垫于滤纸上。 8. 将卡盒顶半部锁紧，完成组装。
四、蛋白从胶转移至膜 1. 按正确方向将卡盒放入装满转移液的转移槽内。 2. 用冷却的方式以100 V电泳转移蛋白30-60分钟，或于冷却室内14 V 稳压下电泳过夜。 3. 从杂交装置卸下膜，用软头铅笔或记号笔标记方位。
五、丽春红S或印度墨水染色(可选项) 1. 将膜放入盛有丽春红S工作液的盘内，轻摇孵育5-10分钟。 2. 蛋白带显色后，用去离子水在室温下洗涤数次。
六、封闭膜 1. 室温下将膜放入10 ml封闭液中(0.1 ml/cm2)，于摇床上轻摇1-2小时。 2．用10 ml TBST洗膜5分钟，共3次。
七、目的蛋白与一抗的结合 1．将一抗（适当的稀释）加入10 ml一抗稀释缓冲液，膜置于其中并于室温轻摇2小时或4ºC过夜。 2. 用10 ml TBST洗膜5分钟，共3次。
八、与二抗孵育 1．将与HRP结合的二抗（1：5000）加入10 ml封闭液中，置于膜室温下轻摇1小时。 2. 用10 ml TBST洗膜5分钟，共3次。
九、蛋白的检测 1．室温下用10 ml LumiGLO温育并轻摇膜1分钟。 2. 倒尽冲洗液，注意勿让膜干燥，将膜用塑料膜包裹并暴露于X光片。最初曝光10秒可提示恰当的曝光时间。 * 由于检测反应的动力学，LumiGLO温育后即刻信号最强，随后的2小时逐渐减弱。
Western杂交最常出现的问题是背景信号过高。最好的降低背景的方法（大多数情况下）是进一步稀释一抗浓度。其他的解决方法包括使用含有去污剂的封闭缓冲液，使用其他封闭试剂(如酪蛋白氨基酸，牛血清白蛋白，血清)，以及减少蛋白的上样量。
所有步骤均要使用去离子的蒸馏水。
由于手上的油会影响蛋白的转移，所以在操作滤纸，胶以及膜时，应带上手套。对胶进行平衡可以防止在转移过程中胶的大小发生变化。胶大小的轻微改变都将导致模糊的转移效果。
通常蛋白的转移会在1-6小时完成，但分子量高的大分子需要更长的时间。低电压过夜电泳较为可靠。
杂交中多条色带的出现，可通过几个办法来解决。可以设立不加一抗的对照，以判定是否是由于二抗引起。使用不同来源的二抗或类似的试剂代替二抗，可帮助找到原因。
如果出现低于目的蛋白分子量的假带，则说明蛋白在实验中发生了降解。使用蛋白酶抑制剂会有帮助。
如果无带或弱带发生，则可增加蛋白上样量，或增加一抗和/或二抗的量。
一些抗体会由于去污剂的存在而不与蛋白结合。在实验之前，应对所用抗体的资料进行查询。