人体脂肪MSCs培养与分离方法

人体脂肪间充质干细胞培养与分离方法：1.获取成人脂肪组织，使用手术吸脂的方式获得目标脂肪组织。2.将使用吸脂手术取得的脂肪组织通过D-Hank’s把麻醉药和血细胞洗涤干净。3.洗涤后用0.075%的I型胶原酶37摄氏度消化一小时。4.将未消化组织使用100目筛网过滤掉。5.室温、1400转/min、离心十分钟，将上清去除。6.再次使用D-Hank’s重悬洗涤2次(室温、1200转/min、离心七分钟)，将胶原酶去除掉。7.离心收集细胞。人体骨髓间充质干细胞的分离方法：1.无菌采集健康志愿者骨髓5-10毫升装入无菌肝素管中。2.用一支无菌离心管，装入D-Hank’s稀释后的骨髓液调整骨髓浓度为107/毫升并计数。3.另外取一支清洁的离心管，将上面获得的骨髓液细胞核恢复至室温的Ficoll淋巴细胞以1：1的比例混合，添加时操作要仔细不能破坏界面。4.将配好后的离心管置入离心机中，室温、1500转/min、离心二十分钟。5.将离心管取出后，保证无菌操作仔细吸取白膜层变能够得到单个核细胞。6.用D-Hank’s把单个核细胞洗涤2次(室温、1200转/min、离心七分钟)并计数。间充质干细胞（MSC）的接种和扩增培养：1.用2×106 /毫升的密度接种细胞，放入CO25%的培养箱中37摄氏度培养。2.两天后换液，将没有挂壁的细胞去除掉，然后每三天半量换液。3.在细胞融合达到70%~80%后，使用0.125%的胰酶常规消化。4.细胞按照1:3的比例进行传代，第2或第3代细胞可以用于实验中。成肌诱导：1.使用第2或者第3带的间充质干细胞按1×105个细胞/孔，接种到6个孔板。2.经过扩增培养特别十二小时后，进行下一步成肌诱导培养。培养液成份：DMEM、2%FCS、5%马血清（horse serum，HS）、50 µM氢化可的松（hydrocortisone）和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。3.每三天半量换该诱导液。内皮诱导：1.用Matrigel (factor reduced，BD Bioscience)包被24孔培养板。2.按5×104个细胞/孔接种间充质干细胞。3.配制内皮诱导液：M199、2%FBS、50ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。