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如何进行叶绿素含量测定(用丙酮法)

[实验目的]熟悉在未经分离的叶绿素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算
方法/步骤
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[实验原理]在叶绿素a和b的吸收光谱曲线中,红波波长范围内,叶绿素a的最大吸收峰在663nm,叶绿素b的最大吸收峰在645nm。吸收曲线彼此又有重叠,叶绿素a、b在D652nm的吸收峰相交,两者有相同的比吸收系数(均为34.5),也可以在此波长下测定一次(D652)而求出叶绿素a、b总量:CT=(D652×1000)/34.5    根据Lambert—Beer定律,最大吸收峰不同的两个组分的混合液,它们的浓度C与光密度OD之间有如下关系:OD1=Ca·ka1+Cb·kb1        (1)OD2=Ca·ka2+Cb·kb2        (2)Ca为组分a的浓度(g/L)  Cb为组分b的浓度(g/L)OD1为在波长λ1(即组分a的最大吸收峰波长)时,混合液的光密度OD值。OD2为在波长λ2(即组分b的最大吸收缝波长)时,混合液的光密度OD值。ka1,kb1,ka2,kb2分别为组分a,b的比吸收系数,即组分a(b)的浓度为(1g/L)时,其在相应波长(λ1,λ2)时的光密度OD值。叶绿素A和B的80%丙酮溶液,当浓度为1时,比吸收系数K值如下表:波长/nm叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将表中数值代入上式(1),(2)并整理的:Ca=0.01272OD663-0.00259OD645Cb=0.02288OD645-0.00467OD663若把Ca,Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L,则上式可改写为下列形式:Ca=12.72OD663-2.59OD645       (3)     Cb=22.88OD645-4.67OD663         (4)Ct=Ca+Cb=8.05OD663+20.29OD645    (5)Ct为叶绿素总浓度,单位为g/L。利用(3),(4),(5)式即可计算出叶绿素A和B及总叶绿素的浓度(g/L)。

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[器材与试剂]实验仪器:高级型分光光度计,离心机,台天平,剪刀,研钵,漏斗,移液管实验试剂:丙酮,碳酸钙      实验材料:植物叶片

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[实验步骤]1.取新鲜叶片,剪去粗大的叶脉并剪成碎块,称取0.1G放入研钵中加80%丙酮少量,少许碳酸钙和石英砂,研磨成匀浆,再加80%丙酮,将匀浆转入离心管,并用适量80%丙酮洗涤研钵,一并转入离心管,用80%丙酮定容至10ml。离心。(室温下于暗处浸提)2.取浸提液,用722型可见光分光光度计比色,测定663nm、645nm、652nm波长处的吸光值,用80%的丙酮做参比。按公式计算叶绿素a、叶绿素b,并计算得出叶绿素总含量(a+b)。

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[实验结果]叶绿素a含量(mg/g)=(12.72A663-2.59A645)*Vs/1000w                  叶绿素b含量(mg/g)=(22.88A645-4.67A663)*Vs/1000w                   Vs:提取液总体积(ml)

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