多药耐药（MDR）是指肿瘤细胞一旦对某一种药物产生耐药性，对其他结构和作用机制完全不同的抗癌药物也产生交叉耐药，导致某些联合化疗方案失败，是一种光谱耐药现象。90%肿瘤患者死亡与其产生多药耐药有关。其分为两类：内在性，肿瘤细胞对药物不敏感；获得性，肿瘤细胞在药物的启动下产生耐药性。膜糖蛋白介导的药物外排机制，是指药物转运的改变，导致肿瘤细胞内药物浓度的下降，产生MDR。P-gp是MDR1的基因编码产物，是一种ATP依赖性膜转运蛋白。P-gp位于细胞膜，其主要功能是天然毒素，内源性代谢物及细胞毒性物质的外排。但P-gp也可将疏水亲脂类药物泵出体外，降低细胞内药物浓度，从而引起MDR。P-gp还保护耐药细胞免于细胞毒性药物诱导多种caspase依赖性凋亡。MRP能识别和转运与谷胱甘肽耦合的底物，增加药物外流，降低细胞内药物浓度，还能调节内源性离子通道和载体功能，如：Ca+通道，K+通道等。MDR酶介导机制是由MDR相关酶活性的和含量的变化而产生MDR。TOPOⅡ是一种解旋酶，与DNA结合后解开其DNA双链，产生裂解复合物。神经酰胺主要导致细胞分化，生长阻滞和凋亡。检测细胞内药物浓度或检测相关分子的表达来研究药物的抗多药耐药作用。常用的方法：FCM（流式细胞术）高效液相法（HPLC）RT-pcr，western-blot等。
工具/原料
细胞 对应的科学仪器及试剂
流式细胞术检测药物浓度
1
细胞经药物处理后，加入PBS，离心，重悬于含10%FBS培养基中。
2
加入罗丹明-123或柔红霉素，对照组加PBS，37℃暗处孵育1h。（荧光染料与细胞培养后，通过流式细胞仪测定荧光信号强度，可反映细胞内药物浓度，与对照组比较，即检测细胞的药物输出功能，判断细胞的耐药程度。）
3
用冷冻的培养基于4℃离心2次，5min。
4
重悬于冷PBS中，随后用流式细胞仪检测。
ＨＰＬＣ检测细胞内药物浓度
1
在预先培养２４ｈ，生长良好的细胞悬液中加入一定量的待测药物，培养２４ｈ后，用ＰＢＳ洗３次，去上清液。
2
加蒸馏水，反复冻融使细胞破裂，混匀，高速离心３０ｍｉｎ，上清液供ＨＰＬＣ分析。
3
ＨＰＬＣ法检测时选择最佳的色谱条件，以待测药物不同浓度的标准液绘制浓度－峰高标准曲线，再检测细胞液，通过标曲，得到药物浓度。
ＲＴ－ＰＣＲ检测耐药相关分子的表达
1
取肿瘤细胞，采取异硫氰酸胍－酚－三氯甲烷法提取总ＲＮＡ。
2
含总ＲＮＡ，ＯＬｉｇｏ（ｄＴ）引物，转绿缓冲液，ＲＮａｓｅ抑制剂，逆转录酶逆转录体系中制备ｃＤＮＡ。
3
进行ＰＣＲ，ＭＤＲ１引物，进行３０个循环的变形（９４℃,４５ｓ）－退火（６０℃,４５ｓ）－延伸（７２℃,１ｍｉｎ）。
4
扩增得到的ｃＤＮＡ可用凝胶扫描仪在１.５％琼脂多糖凝胶上以溴化乙锭染色并分析。内参为ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ。
5
用灰度分析软件分析ｍＲＮＡ的表达水平。
多药耐药相关蛋白表达检测
1
ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ：样品分离转膜杂交，显色检测
2
流式细胞术，检测蛋白含量信息。
Ｐ－ｇｐ活性检测
制备胞质膜，以硫酸亚铁钼蓝显色法测定ＡＴＰ水解产生的磷酸，并做动力学分析。
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