ECL Western特异发光检测试剂盒用于辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白或核酸检测。下面以超敏型ECL发光液Enlight-Plus为例，说一下检测实验步骤。
1.检测前实验操作
1. 常规电泳、转膜、HRP 标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。以下操作在室温进行。 注意： 推荐的抗体稀释度为: 储存液浓度为1mg/ml 的一抗推荐稀释度：1:1000-1:5000 或 0.2-1.0μg/ml 储存液浓度为1mg/ml 的二抗推荐稀释度：1:2000-1:10,000 或10-50ug/ml
2.新鲜配制发光工作液
将BufferA 和Buffer B 按1:1 比率混合，制成发光工作液(每25px2膜需要0.125ml 发光工作液)。转移到清洁的塑料小盒中。
3.膜转移
用镊子将漂洗过的膜取出，将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的洗液，但勿使膜完全干燥。将膜转移至有发光工作液的塑料小盒中，使其完全浸泡，轻轻摇晃，室温孵育几十秒到1 分钟。
4.膜固定
用镊子将膜夹起5-10 秒，并将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的发光液，迅速将膜完全包裹于洁净保鲜膜内，去除气泡和褶皱，蛋白面朝上固定于X 片暗盒内。
5.显影
在黑暗中一次重叠放入3 张X 光胶片，30 分钟或更长时间后全部取出显影。
6.蛋白杂交
对同一张膜进行多次蛋白杂交：用PBST 或TBST 洗涤掉发光液（10min×3 次），然后从开始一抗杂交即可。
注意事项
1
1. 发光液不宜暴露于强光下时间过久，请避光保存，在暗室操作。
2
2.为了得到最佳的曝光效果，优化一抗、二抗的稀释比例。
3
3. 避免使用NaN3 回收HRP 偶联的抗体，因为NaN3 能抑制HRP 的活性。