试剂：1. 双蒸水（实验室制备） 2. 包被液：碳酸盐缓冲液 Na2CO3 159mg NaHCO3 293mg ddH2O to 100ml 3. 1×PBS（实验室配置） NaCl 8g KCl 0.2 KH2PO4 0.27g Na2HPO4 •12H2O 3.58g ddH2O to 1L 4. PBST（实验室配置）：Adding 500ul Tween20 into 1L 1×PBS. 5. Blocking solution: 2% BSA BSA 2g 1×PBS to 100ml 6. BSA（Beyotime， Cat Number：ST023） 7. Antigen (PEPRO TECH, Cat:200-04R ), Dissolved in ddH2O and prepared 100ug/ml stocking solution. 8. Human Antibodies (Mammalian cell expressed) 9. secondary antibody(HRP conjugated)（Sino biotechnology, Cat: SSA002. Working solution：dilute secondary antibody at 1:2000 with 1% BSA . 10. TMB（Solarbio，Cat Number：PR1200） 11. 2M 硫酸（实验室配置）
材料： 1. 15ml 离心管（Nunc） 2. 96-well ELISA 酶标板（Jetbio） 3. 300ul 多通道移液器（RAININ） 4. 10ul、200ul、1000ul 单通道移液器（RAININ） 5. 1.5ml 离心管
仪器： 1. 恒温培养箱（上海一恒） 2. 酶标仪（MD Flexstation3）
方法：1. 配制抗原包被液。2. 将配好的抗原包被液加入到加样槽中，使用12 channel pipette (使用前需用手将每一个tip头压紧) 加入96-well 酶标板中，每孔100ul。加样时要注意避免气泡并避免液体粘附于孔壁。加样时使pipette的各个tip对准96-well一行中的各个孔，按照由B行至G行的顺序，逐行加入。
1. 将96-well酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后， 4℃ 冰箱中孵育过夜。2. 第二天，将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。3. 使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入1×PBS，每孔300ul。4. 室温静置3min，弃溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。5. 重复步骤5和6，共计三次。 6. 使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入Blocking solution，每孔300ul。7. 将酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。(37℃ or lower?)8. 将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。9. 使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入PBST，每孔300ul。10. 室温静置3min，弃溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。11. 重复步骤11和12，共计5次。 重复步骤5和6，共计2次。12. ※将稀释好的抗体依次加入到相应的孔中，每个样品做三个复孔，每孔100ul。(加样方法，方向如下。)
1. 将酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。2. 将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。3. 重复步骤11和12，共计5次。 重复步骤5和6，共计2次。4. 使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧)向96-well 板中按照加抗原包被液的方式逐排加入二抗working solution，每孔100ul。5. 将酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。6. 将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。7. 重复步骤11和12，共计5次。 重复步骤5和6，共计2次。8. 确保环境温度为25℃，使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧) 按照加抗原包被液的方式，向96-well 板中逐排加入TMB溶液，每孔100ul。9. 25℃下，保温3min，立即使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧) 按照加抗原包被液的方式，向96-well板中加入2M H2SO4 溶液终止反应。10. 静置5min后，将96-well板置于FlexStation III 于450nm检测读数。 (在FlexStation III的工作站软件中选择Endpoint/HRP-TMB 方法)※ 抗体稀释方法：Prepare 0.1ug/ml antibody solution；Then to prepare antibody working solution as below：
使用12 channel pipette (使用前需用手将每一个tip头压紧);