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怎样制作石蜡切片

苏木素与伊红对比染色法(简称H.E.对染法)是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛,对组织细胞的各种成分都可着色,便于全面观察组织构造,而且适用于各种固定液固定的材料,染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色,细胞核被苏木素染成蓝紫色,细胞质被伊红染色呈粉红色。
工具/原料

1.器材:切片刀,切片机,单面刀片,恒温箱,蜡杯,解剖刀,解剖剪,解剖盘,解剖针,培养皿,镊子,毛笔,染色缸,盖玻片,载玻片,玻片盘,树胶,树胶瓶,显微镜,温度计,脸盆,水浴锅,温台,剪刀,小台木,洒精灯,石蜡模子,包埋纸盒,烧杯,熔蜡炉。2.试剂:各级浓度酒精(50%、75%、85%、95%、100%)、二甲苯、石蜡、1%伊红酒精溶液,1%盐酸酒精溶液,中性树胶,波因氏固定液,埃利希苏木精染液,。3.材料:鱼肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜。

步骤/方法
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1.取材

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敲脑法处死鱼,打开腹腔,剪取肝组织(或其他组织)。

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切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透,通常以5mm×5mm×2mm或1mm×1mm×2mm为宜。取下所需要的肝组织,切成一小块2-3mm厚。

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2.固定

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将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下,立即投入波因氏固定液中固定,固定24h。

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3.洗涤

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材料经固定后,流水冲洗6小时或过夜。

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4.脱水

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材料依次经75%、75%、85%、95%、95%、100%、100%各级乙醇溶液脱水,各2-3h。第二次75%乙醇溶液脱水后可长期保存,85%乙醇溶液脱水后可过夜保存,第二次95%乙醇溶液脱水后可加入少量伊红粉染色以便于修整蜡块。

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5.透明

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纯酒精、二甲苯等量混合液2-3h,二甲苯Ⅰ2h、Ⅱ2h(至透明为止)。

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由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明状态。

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6.透蜡

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放入2/3二甲苯和1/3石蜡混合液,1/2二甲苯和1/2石蜡的混合液,再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟。此时可过夜保存。

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透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等),使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱内进行,并保持箱内温度在55-60℃左右,注意温度不要过高,以免组织发脆。一般置于恒温箱1h。用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间,包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素,选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56℃,植物材料用的石蜡熔点为54~58℃。

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7.包埋

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包埋时,用镊子夹取石蜡模子(金属质地)在酒精灯上稍加热,放在平的桌面上,从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯,倒入少许石蜡。再将镊子在酒精灯上稍加热,夹取材料将组织块放入蜡模中,排列整齐。再放上包埋盒,轻轻倒入熔蜡。注意保持组织块的整齐排列,包埋动作要迅速,否则熔蜡凝固。轻轻将纸盒两侧的把手提起,慢慢地平放在面盆,并立即使它沉入水中,使盒中包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固(约30min)后即可取出备用。

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8.切片

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①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。

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②将切片刀固定在刀夹上,刀口向上。

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③摇动推动螺旋,使石蜡块与刀口贴近,但不可超过刀口。

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④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置,刀片与石蜡切片约成15度左右。

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⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度,一般为6-10微米。

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⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮,让蜡块切成蜡带,左手持毛笔将蜡带提起,摇转速度不可太急,通常以40-50r/min。

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⑦切成的蜡带到20-30cm长时,右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起,以免卷曲,并牵引成带,平放在蜡带盒上,靠刀面的一面较光滑,朝下,较皱的一面朝上。

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⑧用单面刀片切取蜡片一小段,放在载玻上加水一滴,置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。

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⑨切片工作结束后,应将切片刀取下用氯仿或二甲苯擦去刀上沾着的石蜡,把切片机擦拭干净妥为保存。

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9.展片、贴片、烤片

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打开水浴锅,使水温维持在40-45℃,另准备30%乙醇溶液。

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①切片时,将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。

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②用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带,放在乙醇溶液的水面上,使切片展开。

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③小镊子轻轻地将连在一起的切片分开,用一个载玻片将已展开的切片捞至温水中,使之充分展开。

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④另取洁净的载玻片,捞起展开的切片,使其位于切片中央,另一端(磨边,粗糙的一端)磨面上标记或贴上标签,放于切片架上。

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⑤60℃烤箱烤片2h至蜡熔化。此时可过夜保存。

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10.脱蜡复水

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石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各15min,然后放入1/2二甲苯和1/2无水乙醇的混合液,1/2二甲苯和1/2无水乙醇的混合液各3min,再放入100%、100%、95%、90%、85%、75%、50%各级酒精溶液中各3-5min,再放入蒸馏水中3min。

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11.染色

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切片放入苏木精中染色约10-30min。注意埃利希苏木精染液的成分:苏木精1g,纯酒精50ml,冰醋酸5ml,甘油50ml,钾矾(硫酸铝钾)约5g(饱和量),蒸馏水50ml。

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染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低,适当缩短或延长。室温高时促进染色,染色时间可短些,否则可适当延长时间,冬季室温低时可放入恒温箱中染色。用显微镜观察染色是否合适,否则重新脱蜡复水再染色。

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12.水洗

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用自来水流水冲洗约1-2min。使切片颜色变蓝(或放入碱性水中也可),但要注意流水不能过大,以防切片脱落。

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13.分化

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将切片放入0.5%盐酸乙醇液中褪色,约2秒至数十秒钟。见切片变红,颜色较浅即可。这一步骤是H.E.染色成败的关键,,如分化不当会导致染色不匀,或深或浅,得到的切片染色效果差。如果染色适中,可取消此步骤。注意1%盐酸乙醇液的成分:盐酸1份和50%酒精100份。

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14.漂洗

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切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。

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15.脱水Ⅰ

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切片入50%乙醇→75%乙醇→85%乙醇中各2min。

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16、复染

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用1%伊红乙醇液对比染色1-3min。注意1%伊红酒精溶液的成分:伊红1g溶于100ml95%酒精溶液。

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伊红主要染细胞质,着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合,如果细胞核染色较浓,细胞质也应浓染,以获得鲜明的对比。反之,如果细胞核染色较浅,细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染,促使细胞质容易着色,并且经乙醇脱水时不易褪色。

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17.脱水Ⅱ

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将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色,然后放入无水乙醇中3-5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。

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18.透明

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切片放入1/2二甲苯和1/2无水乙醇的混合液、二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。此时可过夜保存。

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二甲苯应尽量保持无水,应经常更换,或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象,说明脱水未尽,应退回乙醇中重新脱水,否则切片难以镜检。

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19.封藏:中性树胶封存

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因切片经二甲苯透明,使用中性树胶作为封藏剂,树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。

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封藏的方法:

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封片前应根据材料的大小,选用不同规格的盖玻片。材料透明后,在桌上放一张洁净的吸水纸,将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上(切片的一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(千万不能待二甲苯干燥后再进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角,然后再缓慢地将盖玻片放下,这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足,可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多,可在干燥以后用刀刮去,并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。

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END

注意事项
1

1.取材注意事项

2

(1)取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

3

(2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择,尽可能不要损伤所需要的部分。

4

2.固定注意事项

5

(1)一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用。

6

(2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。

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(3)固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的20~30倍,有些水分多的材料,中间应更换1-2次新液。

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(4)材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材料在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

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4. 脱水注意事项

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(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分和酒精挥发。

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(2)在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水器吸尽皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。

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(3)在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。

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(4)在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。

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(5)如需过夜,应停留在75%酒精中。

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(6)脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象。

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5.透明注意事项

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(1)使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中的水分进入和透明剂的挥发。

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(2)更换每级透明剂,动作要迅速,一方面为了不使材料块干涸,另一方面能避免吸收湿气。

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(3)在透明过程中,如果材料周围出现白色雾状,说明材料中的水未被脱净,应退回纯酒精中重新脱水,然后再透明。

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6.透蜡注意事项

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(1)尽量保持在较低温度中进行,以石蜡不凝固为度。

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(2)透蜡温度要恒定,不可忽高忽低。

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(3)操作要迅速,力求在最短的时间内完成石蜡透入过程,以免引起组织变硬、变脆、收缩等。

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