G418筛选稳定高表达细胞株

一、确定单克隆筛选的G418浓度(1)     观察正常CHO细胞状态良好，待贴壁率 95% 以上，弃旧培养液，加入1 mL 0.25％胰酶溶液。放入5% CO2 培养箱孵育 5 min，加入F-12K（含10%FBS）培养基终止胰酶消化，800 rpm 离心5 min ，弃上清。(2)     用F-12K（含10%FBS）培养基重悬细胞，轻轻吹打细胞 8-10 次，成单个细胞。将细胞以30%密度接种于24孔板中。(3)     待细胞密度达50%左右，将孔中培养基吸除，PBS洗涤两次，每孔加入不同浓度G418筛选培养基，3天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低浓度细胞全部死亡为基准。设定G418浓度为0、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1000μg/mL、1100μg/mL。此次我做的是600μg/mL以上的细胞都死亡了，因此最终选择800μg/mL用于后续实验

二、G418筛选稳定高表达细胞株1.        将重组质粒瞬时CHO细胞，48h后Western Blot 鉴定转染效率，同时将细胞进行传代，此时可加入G418，使其终浓度达到800μg/ml。多余细胞可冻存。（注：转染时需转染两盘细胞，一盘鉴定，一盘用于筛选）2.    每天观察细胞生长状态，48h换液一次，维持G418浓度（800μg/ml）。3.    筛选第6天，观察细胞生长状态，细胞会出现大量死亡，此时选用适应性培养基，细胞传代，并将剩余细胞做好标记冻存。若死细胞过多，细胞需及时换液，因为死亡的细胞会释放有毒物质，使表达的阳性细胞死亡。适应性培养基：转染前，在细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液（未变黄），离心3000rpm，10min，吸上清0.22um过滤，和新鲜的培养液按1：1混合4℃备用。4.    第7天至第14天，每三天对细胞进行传代。第14天，可见细胞成簇状分布，有抗性克隆出现。对细胞进行计数后，以10个/ml,接种于96孔板，进行高表达细胞株筛选。5.单克隆种于96孔板后，第2天可进行观察，标记出每个孔中仅有一个细胞的孔，细胞生长到5-7天成簇状分布，此时将标记出的单克隆细胞传代至48孔板。（注：应该每天对标记的孔进行观察，排除不是单克隆的孔，细胞传代时，将10μL胰酶加入96孔中，在显微镜下观察确定细胞被消化下来后，加入90μL培养基，混匀后全部转至48孔板中。）6.单克隆种于48孔板后，生长5-7天，待细胞密度达70%左右，将细胞传代至25Flask中。7.细胞传代至25Flask后，待细胞密度达到90%左右，以2×106个细胞传代至25Flask，48小时后收集细胞培养上清Western Blot鉴定蛋白表达。下图为筛选14天细胞状态，细胞成簇状分布，存活细胞我们可以认为是阳性克隆细胞，但是如果将FBS浓度增加到20%，也可能细胞不会成簇状分布，因为FBS会促进细胞增殖，因此细胞生长状态和密度都比较好一些。