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通用植物RNA提取方法及步骤

独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,,然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,DNase直接在柱上消化残留DNA,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除, 最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
工具/原料
1

转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机

2

乙醇,研钵(可选)

3

EASYspin通用植物RNA快速提取试剂盒1个

方法/步骤
1

第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!直接研磨法(推荐):a.  新鲜植物组织称重后取100mg迅速剪成小块放入研钵(冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100mg放入研钵), 加入1 ml 裂解液RPA室温下充分研磨成匀浆,注意应该迅速研磨让组织和裂解液RPA立刻充分接触以抑制RNA酶活性。b.  将裂解物转入离心管,剧烈摇晃振荡15秒,13,000rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片。c.  取480μl裂解物上清(在不超过RNA吸附柱能力的情况下可以取更多或者全部上清,这样可以提高产量)转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。d.  立刻接操作步骤的步骤3。

2

液氮研磨法:a.  取500μl裂解液RPA,转入1.5ml离心管中。b.  液氮中研磨适量植物组织成细粉后,取50mg细粉转入上述装有RPA的离心管, 立即用手剧烈振荡20秒,充分裂解。c.   用吸头吹打混匀帮助裂解或者剧烈涡旋震荡直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。d.  将裂解物13,000 rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片。e.  取裂解物上清(在不超过RNA吸附柱能力的情况下可以取更多的上清,这样可以提高产量)转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。f.  立刻接操作步骤的步骤3。注意:以上液氮研磨法用户可以根据需要加倍处理,可以提高产量。也就是使用1ml的裂解液RPA和100mg的样品。

3

将混合物(每次小于720μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13,000 rpm离心2分钟,弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去,膜上没有残留,如有必要,可以加大离心力和离心时间。

4

加350μl 去蛋白液RW1,室温放置1分钟,13,000rpm 离心30秒,弃掉废液。

5

DNase I工作液配制:取45μl DNase I buffer和5μl RNase free DNase I在离心管轻轻吹打混匀成工作液(处理多个离心柱子要按照比例放大制备工作液)。

6

向吸附柱RA 中央加入50μl 的DNase I 工作液,室温(20-30℃)放置15 分钟。注意直接将工作液滴在膜中央上,不要让工作液滴在O型圈或是离心柱管壁上。

7

向吸附柱RA 中加入350μl去蛋白液RW1, 12,000 rpm 离心30秒,弃废液,将吸附柱放回收集管中。

8

加入500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),13,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。

9

将吸附柱RA放回空收集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10

取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water(事先在70-90℃水浴中加热可提高产量), 室温放置1分钟,12,000 rpm 离心1分钟。

11

如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤10,合并两次洗液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。洗脱两遍的RNA洗脱液RNA浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。注意:如果不需要做荧光定量PCR,仅仅做普通的反转录,克隆基因片段,可以省略DNA酶柱上消化的步骤,具体就是第4步骤的“加350μl 去蛋白液RW1”改成“加700μl 去蛋白液RW1”,同时省略步骤5,6,7。

注意事项
1

常温成份不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。

2

避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

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