原理:各种蛋白质分子上可能带有不同的电性,经过离子交换管柱,可依其分子带电性的差异而分离开来。下面以Abbkine实战经验来讲解:
工具/原料
1
仪器设备:塑料管柱
2
收集器-干净试管
3
浓缩用离心机 (低速5,000 rpm)
4
浓缩离心管
5
药品试剂:胶体
6
Buffer A-0
7
Buffer A-300 溶离液
8
Buffer A-500 溶离液
方法/步骤
1
将管柱架好,并将三向阀及软管等组合完成。
2
震荡DEAE Sephacel 胶体使的悬浮,小心倒入管柱中,让胶体慢慢沈降,在沈降过程中随时加入buffer A-0,勿使胶体干掉。
3
待胶体沈降完全后,高度应在15 cm 左右。胶柱以buffer A-0 一直流洗,流速快慢可以不考虑;连接好收集器,每试管收2.5 mL.离子交换法的胶体平衡极为重要,可测流出液的pH 或离子浓度,看是否与buffer A-0 相同,若不一样则需要再流洗的。
4
样本的添加方法同上述胶体过滤法,并启动部分收集器开始收集,当样本全部没入胶体后,再加入同体积buffer A-0.以buffer A-0 流洗50 mL 后,去除胶体上方的缓冲液,但勿使胶体干掉。
5
然后依序以buffer A-300, buffer A-500 溶离的,每批次流洗各50 mL,注意更换浓度时,胶体上方勿残存上一种溶液。
6
收集后,进行蛋白质定量分析以及GUS 活性测定,结果作图。
7
收集GUS 活性区,并以 浓缩,记得要保留100 μL.
8
离子交换胶体以buffer A-0 洗过50 mL 后,收起来交回。