更有效的蛋白提取和免疫印迹分析

收集细胞5×106，用100µlRIPA裂解缓冲液（50mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，1% Nonidet P-40，0.5% Na-deoxycholate，0.1% SDS），临用前加入终浓度各为1mM 的PMSF、NaF、Na3VO4以及1µg/ml cocktail蛋白酶抑制剂冰上裂解30min，12000rpm离心20min后，收集上清即是全蛋白

再加入1/5体积倍数的6×Loading Buffer（0.35mM Tris-HCl pH 6.8，36% glycerol，10% SDS，5% b-mercaptoethanol，0.012% Bromophenol Blue）煮沸10min，-80℃冻存备用。取20µg蛋白在含SDS10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后转移到PVDF膜上；PVDF膜是用TBS-T（20mM Tris-Hcl PH7.4，150mM NaCl，0.1% Tween20）配制的5%脱脂牛奶25℃封闭2小时，之后与一抗在25℃孵育2小时或在4℃孵育中过夜。经TBS-T漂洗3次，每次5-10min后，在水平摇床上与辣根过氧化物酶偶联二抗25℃孵育1小时。TBS-T漂洗3次×10分钟。

进行化学发光显影，X光片记录影像。b-actin作为内参调节不同样品的上样量。