Nramp基因原核表达载体的构建方法

首先，对RT-PCR所获得的Nramp基因的回收和纯化，目的片段与pET-32a(+)载体双酶切胶回收后的凝胶电泳结果。

然后，在两者连接后获得的重组载体pET-32a-Nramp转化DH5a,  随机挑取单克隆摇床培养过夜，提取质粒用BamH I和Hind Ill双酶切。

然后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳发现在5000bp和750bp左右有两条DNA条带，证明Nramp基因目的片段成功插人pET-32a(+)载体中。随机挑取4个单克隆提取质粒测序，结果表明成功构建了表达载体)。

然后，在实时荧光定量PCR检测结果表明，草鱼不同发育时期和不同组织中Nramp基因的mRNA表达量差异显著(P<0.05)，Nramp基因在胚胎发育不同阶段的表达量差异显著(P<0.05)，有随着胚胎发育的进行而显著增高的规律。

然后，在胚胎发育结束进入幼鱼期时表达量达到最高，与卵裂期相比差异显著(P<0.05)。说明随着草鱼活动范围的扩大和环境的复杂化，病原微生物的刺激增大，Nramp基因的表达量显著增加，以增强免疫力。

最后，在健康成鱼不同组织中，以心脏组织作为标准进行相对定量分析，结果显示Nramp基因的表达量在不同组织间也有显著差异(P<0.05),以肝中的表达量最高，其次在肠、脾、头肾中的表达量较高，而在鳔和眼中的表达量最低。