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细胞增殖检测中的注意事项

细胞增殖是生物体的重要生命特征,生物以细胞细胞分裂的方式产生新的细胞,补充体内已经衰老和死亡的细胞,用以维持新陈代谢,同时细胞增殖也是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。故细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。细胞增殖检测技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学、遗传学、免疫学、药学等研究领域。目前常用的细胞增殖检测方法有MTT、CCK-8、Edu检测法等。下面就针对于这三种常用检测方法的注意事项做一综述。
方法/步骤
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MTT检测法1.       MTT的配制:MTT对菌和光十分敏感,配制过程中注意无菌环境及避光,使用超净台配制时,可以将超净台的灯光先关掉。最好现用现配,避光4℃保存两周内有效,也可配置成储存液,-20℃保存,避免反复冻融。MTT具有致癌性,在配制的过程中,应注意防护,避免药物直接触碰皮肤。2.       细胞接种密度的确定:选择适当的接种密度,若密度太大,细胞对药物敏感性降低;若密度过小,则差异性太小。细胞密度控制在103-104之间。3.       血清的影响:高浓度的血清会对细胞的光吸收值长生影响,故细胞培养使用的血清浓度应该控制在10%以下。4.       设置凋零空和空白组,保证实验结果的准确性。5.       使用96孔板接种培养时,合理分配96孔板的位置,四周的孔用PBS来填充,因为置于培养箱中培养时,边缘孔的水分蒸发会很快,药物易被浓缩,加入PBS可以从一定程度上保证实验孔的水分。6.       注意测试药物是否与MTT发生反应:某些具有氧化还原性质的药物,会与MTT发生反应,将MTT还原成为棕褐色沉淀,故如存在此类药物,应在加入MTT前,用PBS对细胞清洗。7.       终止培养,溶解结晶:去除上清时,切记勿将MTT结晶体吸走,操作慎重,以免影响吸光值。可使用平板离心机将96孔板进行离心,或将培养板倾斜放置,用枪头尖部慢慢小心将上清液去除。

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Edu检测法1、  加入含有Edu的培养基时,培养基的用量以没过细胞为适宜。2、  根据培养细胞种类不同,确定细胞生长周期,再进一步确定Edu培养基的培养时间,大多数细胞为2小时培育时间。3、  固定细胞前,使用PBS清洗未进入细胞DNA的Edu,一般清洗次数为1-2次,每次5分钟,也根据不同的细胞选择清洗强度,避免细胞流失,造成密度不同。4、  染色完成后,最好立即进行观察 。如若条件限制,请4℃避光保存,保存时间不宜过长,不超过3天。

注意事项
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目前应用较多的是CCK8法

2

必要时可使用engreen的CCK8

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