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怎样做RNA的琼脂糖凝胶电泳

RNA样品电泳后,可见28S、18S及5S小分子RNA条带,则说明完整性好。若有降解可能是操作不当或污染了RNase.。28S和18S RNA比值约为2:1,表明RNA无降解。如比值逆转,则表明RNA降解。电泳中如果在28S 后方还有条带,表明有DNA污染,应用DNase处理后再进行纯化。
工具/原料

试剂:
(1)MOPS缓冲液(10*):0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸(MOPS)(Ph7.0),0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。
(2)上样染料:50%甘油,1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝,0.4%二甲苯蓝。
(3)甲醛。
(4)去离子甲酰胺。v电泳槽清洗:去污剂洗干净(一般浸泡过夜)——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗

步骤/方法
1

将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍,晾干备用。

2

配制琼脂糖凝胶。  ①称取0.5g琼脂糖,置干净的100ml 锥形瓶中,加入40ml蒸馏水,微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。  ②待胶凉至60--70 ℃,依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和0.5μ|溴化乙锭,混合均匀。  ③灌制琼脂糖凝胶。

3

样品准备:  ① 取DEPC处理过的500μ|小离心管,依次加入如下试剂: 10x MOPS缓冲液2ul,甲醛3.5μ|,甲酰胺(去离子)10μ|,RNA 样品4.5μ|,混匀。  ② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟,再置冰上2分钟。  ③ 向管中加入3μ| 上样染料,混匀。

4

上样。

5

电泳:电泳槽内加入1XMOPS缓冲液,于7.5V/ml 的电压下电泳。

6

电泳结束后,在紫外灯下检查结果。

注意事项
1

快速的操作,低温环境,少量取上清 主要是抽提之后吸取上清时要特别小心,只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。

2

提取RNA所用的玻璃容器的处理方法,是用前180度干烤8小时或更长时间;另一种方法是0.1%的depc水浸泡(37度 2小时),然后灭菌水淋洗数次,100度干烤15分钟,然后高压灭菌除去depc.

3

提取RNA所用的枪头,EP管。直接高压烘干即可。如果用0.1%DEPC处理,要在DEPC配置后振摇1小时后再浸泡枪头,EP管方有效。我做的都是将枪头泡在配制好的depc中,摇振过夜,然后倒掉depc注意要到干净,再高压,为了防止仍残留液体可120度干烤一会

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