酵母菌提取蛋白质的方法

玻璃珠破碎制备全蛋白

单因素和正交试验设计

一.玻璃珠破碎 Conzelmann A, Riczman H, Desponds C, BronC. 1988. A major 125 kd membraneglycoprotein of Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母的糖蛋白通过 含肌醇磷脂。EMBOJ 7:2233+2240。 2。优化SDS样品缓冲液中蛋白质的快速提取 Horwath A，Riezman H.1994年。从Sacc酵母中快速提取蛋白质 酿酒师。酵母10:1305+1310。 样本区：                                    10毫升 0.06M Tris HCl，pH 6.8                     0.6毫升1m Tris 6.8 10%（v/v）甘油                           2毫升50%甘油 2%（w/v）十二烷基硫酸钠                2毫升10%十二烷基硫酸钠 5%（v/v）2-巯基乙醇                     0.5毫升2-巯基乙醇 0.0025%（w/v）溴苯酚蓝                  0.1毫升饱和溴苯酚蓝 4.9毫升水

使用前使样品缓冲液新鲜。可将冷冻在一20度的缓冲液~ 6个月。 一。隔夜培养细胞（~1x107细胞/ml；A600=0.7），收集1.5 ml细胞（调整 根据培养物的细胞密度确定的体积）在1.5毫升微乳管中（1分钟，14000xg）。 重要的是不要把细胞培养到高密度。 10微升YPD饱和oV-ernight培养液，注入5 m/SD+essential 在30度生长的野生型ce//s中，16小时的氨基酸使A600的含量为0.5到1.0 150微升YPD饱和培养液，稀释至5 m/YPD，在30℃下培养约5小时 度表示野生型细胞的A600为~0.8。 2。用水清洗1个细胞，然后再次离心收集。 三。在100微升样品缓冲液中重新培养细胞。 四。在95摄氏度下加热5分钟。 五。离心14000xg 5分钟。在SDS页面上每车道装载15微升

分析 酿酒酵母中的RGS蛋白，酶法。_344:617-631， 2002年。 -在步骤1至3中使用无菌技术和无菌溶液。- 一。使用饱和发酵剂培养，接种25至30毫升适当的 125毫升烧瓶中的培养基。 ***因为通常很难估计酵母的生长速度，所以 有助于开始几个25毫升的培养基，每个培养基都有不同的稀释度 发酵剂培养基（例如1:100、1:300、1:900）。 2。在30摄氏度下振荡（250转/分）直到0D600纳米~1.0（这通常是 一夜之间完成）。 ***当一次生长几个菌株时，它们很可能 达到0D600牛米~1。0在不同的时间。如果需要，叠氮化钠（100万库存 在水中，稀释至最终浓度10 mM）可添加至 一旦达到0D600 nm~1，则进行培养。0个。然后可以绘制区域性 在冰上直到其他人准备好。 三。转移至50毫升锥形管中，并在2000 x下离心10分钟 关贸总协定4 C。 四。将每个样品重新放入1毫升10毫米叠氮化钠中，并放在冰上。

5。计算将转换为的重新悬浮单元的体积。0D600 nm读数为10。例如，如果10毫升在0D600 nm处培养=1。0已被定心并重新悬浮。***这一步骤对于平衡细胞（和蛋白质）的数量是必要的在一定体积的全细胞提取物中。6。将计算出的再悬浮细胞体积转移到一个微型胶管中在16000 x g下离心1分钟。7。吸出上清液。8。在200 ul的1X SDS-PAGE样品缓冲液中重新悬浮颗粒。9。立即放入100摄氏度的加热块中10分钟。10。让试管冷却并添加200 ul玻璃珠（Sigma，#G-8772）。11。高速涡流2分钟。第一分钟后反转。***使用泡沫管可以同时旋转多个管把他们绑在一起。12。”用21号针头在每根管子的底部戳一个孔把它放进一个新的微型胶管里。13。以2000 x g离心10秒，将液体排出底部管，把玻璃珠留在顶部管里。14。丢弃玻璃珠，并在16000 x下离心底部管g持续2分钟。这会沉积任何不溶性物质。15。将上清液转移到一个新的微乳管中。储存在-20摄氏度。16。准备使用时，在37摄氏度下加热10分钟，旋涡和离心机16000 x g，持续1分钟