最近小编收到很多问题，其中一个就是下面小编为大家整理一下关于mtDNA的PCR扩增与测序方法的步骤，希望这些方法能够帮助到大家。
方法/步骤
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首先，根据Mabuchi等'报道的鱼类通用引物扩增mtDNA部分序列，剩余基因序列通过引物步移得到。反应模板DNA约为100 ng, 25 μL反应体系包括: Ex Taq 酶0.25 μL (2 U), 10xExTaq Buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL(各2.5 mmol/L),引物各0.5 μL (20 umol/L)。
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然后，PCR反应程序: 94'C预变性3 min; 94°C变性30 s, 60C退火30 s(退火温度依特定引物)，72°C延伸1 min, 35个循环;最后72C延伸10 min, 4'C保存。
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然后，全序列的拼接与注释，通过NCBI BLAST检索，确定所得序列与GenBank中所收录的沙塘鳢属鱼类mtDNA 相应区段有较高序列相似性后，利用测序峰图结果分析软件DNA Baser V和Contig Express。
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然后，将所有片段拼接成一个完整的mtDNA, 辅以人工校正。用Editseq 7.10和Mega 5.0统计序列总长、碱基组成和AT含量等信息;用在线软件tRNAscan-SE 1.2112进行tRNA基因定位并对二级结构进行预测，并辅助人工校正，对于tRNA scan-SE 1.21未能预测的tRNA。
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最后，采用RNA structure 4.615预测茎环结构.mtDNA全序列经MitoFish'4注释后，提交GenBank(KF874495)，用DNAMANS)和Geneious v.5.4构建mtDNA结构简图。
注意事项
上述方法为小编整理所得，希望能够帮助到大家。