大鼠间充质干细胞成骨与脂肪诱导分化方法

大鼠间充质干细胞培养的体外诱导分化成目标细胞，通常需要经过许多个操作步骤并且需要使用到较多的试剂与培养液，在培养时如果使用中赛生物出品的试剂盒与培养基能够极大的简化操作的步骤。下面就如何常规诱导细胞分化中赛生物来做详细的介绍。1.体外定向诱导大鼠间充质干细胞RMSCs分化为成骨细胞：(1)准备无菌有盖玻片(做细胞爬行片)的6孔细胞培养板；(2)按照4×103个/平方厘米的密度将P3代的细胞接种于培养板中；(3)培养细胞至80%融合率后去除孔内培养液，然后在实验组每个孔中加入2毫升成骨培养基，将其置于培养箱内隔天换液一次，共同诱导三周；(4)将10%胚胎牛血清含量的L-DMEM培养液加入对照组中；(5)再第三周的默契加入茜素红S进行染色检测钙沉积。2.茜素红S染色法操作步骤：(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次(2)茜素红染2min。(3)蒸馏水洗5-10s。(4)分化液洗15s。(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。3.体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞：(1)以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片；(2)细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周；(3)对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液；(4)3周末应用油红O染色法检测脂滴形成4.油红O染色法步骤：(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;(2)4%多聚甲醛固定15 min;(3)PBS漂洗两次，每次5min;(4)入60%异丙醇漂洗。(5)入油红O染色15分钟。Devil60%异丙醇漂洗。5.RMSCs成肌细胞诱导分化：(1)准备无菌有盖玻片(做细胞爬行片)的6孔细胞培养板；(2)按照4×103个/平方厘米的密度将P3代的细胞接种于培养板中；(3)培养细胞至80%融合率后去除孔内培养液，加入2毫升含五氮杂胞苷DMEM培养液，置于培养箱中培养1天；(4)去除原培养液加入2%马血清的DMEM培养基培养7至10天；(5)对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液；(6)可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。